L'histidine fournit longtemps

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 15356 (2015) Citer cet article

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La formation de cicatrice gliale entrave la neurogenèse et la récupération fonctionnelle neurale après une ischémie cérébrale. L'histamine a montré une neuroprotection à un stade précoce après une ischémie cérébrale, cependant, son effet à long terme, en particulier sur la formation de cicatrices gliales, n'a pas été caractérisé. Avec divers schémas d'administration construits pour l'histidine, un précurseur de l'histamine, nous avons constaté que le traitement à l'histidine à forte dose au stade précoce et à faible dose au stade tardif démontrait la neuroprotection à long terme la plus remarquable avec une diminution du volume de l'infarctus et une amélioration de la fonction neurologique. Notamment, ce schéma thérapeutique a également fortement réduit la zone de cicatrice gliale et facilité la migration des astrocytes vers le noyau de l'infarctus. Dans le test de cicatrisation et le test de transwell, l'histamine a significativement favorisé la migration des astrocytes. Les antagonistes des récepteurs H2 ont inversé la promotion de la migration des astrocytes et la neuroprotection fournie par l'histidine. De plus, l'histamine a régulé positivement la petite GTPase Rac1 liée au GTP, tandis qu'un inhibiteur de Rac1, NSC23766, a abrogé la neuroprotection de l'histidine et sa promotion de la migration des astrocytes. Nos données ont indiqué qu'un traitement à l'histidine dépendant de la dose / du stade, médié par le récepteur H2, favorisait la migration des astrocytes vers le noyau de l'infarctus, ce qui bénéficiait à long terme de la récupération neurologique post-ischémie cérébrale. Par conséquent, le ciblage du système histaminergique peut être une stratégie thérapeutique efficace pour les lésions d'ischémie cérébrale à long terme grâce à ses actions sur les astrocytes.

L'ischémie cérébrale est la principale cause de décès et d'invalidité chez les adultes. Actuellement, le seul traitement approuvé pour l'ischémie cérébrale est l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant, qui confère une reperfusion à la zone ischémique lorsqu'il est administré dans les 4,5 h suivant l'ischémie. Aucun agent neuroprotecteur thérapeutique efficace n'est encore disponible pour les lésions cérébrales à long terme après une ischémie. Les événements physiopathologiques complexes après une ischémie cérébrale évoluent à la fois dans le temps et dans l'espace1, ce qui entrave le développement d'un agent neuroprotecteur viable2. Par exemple, les antagonistes NMDA sont efficaces pour atténuer l'excitotoxicité neuronale au stade précoce après l'ischémie, alors qu'ils peuvent ne pas favoriser la récupération neurologique à long terme, car les récepteurs NMDA sont cruciaux dans la neuroplasticité3,4.

Les astrocytes sont impliqués de manière critique dans les progrès physiopathologiques neuronaux consécutifs à l'ischémie cérébrale : dès 6 h après le début de l'ischémie cérébrale, les astrocytes s'activent pour faciliter la survie des neurones éventuellement via la défense antioxydante, le soutien métabolique et la sécrétion de substances neuroprotectrices ; ces astrocytes réactifs forment également une barrière pour limiter la propagation de la lésion et la réponse immunitaire locale5,6. Ainsi, une amélioration de la survie des astrocytes est un moyen crucial pour protéger le cerveau contre l'ischémie cérébrale7. Cependant, la cicatrice gliale, une barrière composée en grande partie d'astrocytes, peut entraver la neurogenèse au stade tardif des lésions neuronales ischémiques. En effet, la suppression de la cicatrice gliale peut bénéficier à la neurogenèse et à la récupération neurologique8. Cela soulève la possibilité qu'une stratégie de traitement dépendante de la dose et du stade puisse être un moyen raisonnable de thérapie pour les lésions cérébrales ischémiques en coordonnant ces effets dépendants du temps des astrocytes.

Dans notre étude précédente, il a été constaté que l'histamine protégeait de manière significative les astrocytes des blessures induites par la privation d'oxygène et de glucose9. La régulation à la hausse médiée par les récepteurs H1 astrocytaires des expressions de la glutamine synthétase et du transporteur de glutamate 1 contribue à l'effet protecteur de l'histamine par la clairance du glutamate extracellulaire redondant, ce qui aide à atténuer l'excitotoxicité au stade précoce de l'ischémie cérébrale9,10. De plus, des preuves considérables montrent que l'histamine fournit une neuroprotection à un stade précoce après une ischémie cérébrale11,12. L'administration intrapéritonéale d'histidine, un précurseur de l'histamine, immédiatement et 6 h après la reperfusion, atténue remarquablement l'infarctus induit par l'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO)11. L'histamine est considérée comme ayant un effet neuroprotecteur direct en atténuant l'excitotoxicité induite par le NMDA via les récepteurs H2 et la voie AMPc/PKA13. En outre, l'amélioration de l'activité histaminergique centrale supprime le recrutement des cellules inflammatoires après une ischémie cérébrale14. Pris ensemble, le système histaminergique semble être une cible thérapeutique potentielle pour les lésions cérébrales induites par l'ischémie cérébrale.

Cependant, l'effet à long terme de l'histamine après une ischémie cérébrale n'a pas été étudié, en particulier son effet sur les astrocytes au stade tardif concernant la formation de cicatrice gliale. Étant donné que l'histamine ne peut pas pénétrer directement dans la barrière hémato-encéphalique, l'histidine a été utilisée pour tester les effets à long terme de l'histamine sur les réponses comportementales et histologiques à l'ischémie cérébrale et les mécanismes potentiels sous différents régimes d'administration liés au stade.

Les événements physiopathologiques consécutifs à l'ischémie cérébrale sont compliqués, c'est-à-dire que l'excitotoxicité aiguë et l'infiltration inflammatoire surviennent généralement dans la semaine suivant le début de l'ischémie, alors que la formation de cicatrice gliale et la neurogenèse apparaissent souvent après cela1. Ainsi, dans un premier temps, nous avons expérimenté les doses d'histidine (200, 500 ou 1000 mg/kg) pendant la première semaine, qui sont souvent des doses choisies dans l'étude de l'ischémie cérébrale11,15,16. Nous avons constaté que la dose la plus élevée offrait la protection la plus importante, comme en témoignent le score de déficit neurologique (Fig. 1A ; n = 13–15) et la mesure de la zone de l'infarctus par IRM (Supplément Fig. 1 ; n = 5–6). Ainsi, 1000 mg/kg ont été choisis comme dosage pour la première semaine et différentes autres doses ont été administrées pour les semaines ultérieures. Sous différents schémas thérapeutiques (comme indiqué en tant qu'association dose précoce-dose tardive), nous avons évalué les effets à long terme de l'histidine sur les performances neurologiques et les capacités cognitives en utilisant le labyrinthe aquatique de Morris et le test de conditionnement de la peur, pour les régions cérébrales liées à la mémoire telles que le striatum, le néocortex et l'amygdale sont souvent compromis après tMCAO17,18,19,20. Nous avons constaté que le traitement à l'histidine (1000–500 mg/kg) présentait l'effet protecteur le plus remarquable sur les performances neurologiques (Fig. 1B ; n = 13–15 pour le jour 14 et le jour 28 ; n = 7–9 pour le jour 42 et Jour 56). Dans le test du labyrinthe aquatique de Morris réalisé à partir de 22 jours ou 50 jours après l'ischémie, tous les traitements à l'histidine ont significativement réduit la latence d'échappement dans le processus d'apprentissage spatial (analysé par un modèle linéaire général, P < 0,05 ; Fig. 1D : n = 13–15 ; Fig. .1F : n = 7–9). Cependant, il n'y a pas de différence entre eux dans l'essai de sonde, qui fait référence à la rétention de la mémoire. Dans le test de conditionnement de la peur, le groupe Histidine (His) 1000–500 a montré la meilleure mémoire contextuelle et la meilleure mémoire indicée à 27 jours et 55 jours, par rapport aux autres combinaisons de traitement (Fig. 1E : n = 13–15 ; Fig. 1G : n = 7–9).

L'histidine assure une neuroprotection sur la fonction neurologique et les capacités cognitives après une ischémie cérébrale focale.

Les scores neurologiques ont été évalués à 1 j, 3 j, 7 j après ischémie sous traitement histaminique (A, 200, 500 ou 1000 mg/kg) et évalués à 14 j, 28 j, 42 j, 56 j après ischémie sous traitement du traitement à l'histidine (B, 1000 mg/kg pour la première semaine mais 0, 200, 500 ou 1000 mg/kg pour les semaines suivantes, nommé His 1000–0, His 1000–200, His 1000–500 ou His 1000 –1000). Les capacités cognitives ont été examinées par le labyrinthe d'eau de Morris (D : Jour 22-24 ; F : Jour 50-52) et le test de conditionnement contextuel et indicé de la peur (E : Jour 27, G : Jour 55) après l'ischémie. Les parcours de nage représentatifs du jour 24 en (D) ont été indiqués en (C) et le cercle gris indique l'emplacement de la plate-forme. n = 13–15 pour A, B (Jour 14 et Jour 28), D et E ; n = 7–9 pour B (Jour 42 et Jour 56), F et G. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, par rapport au groupe fictif au cours de chaque jour de test ou de chaque test, # P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, par rapport au groupe tMCAO au cours de chaque jour de test ou de chaque test.

Nous avons ensuite effectué l'évaluation histologique suivant différents régimes de traitement à l'histidine. En utilisant la coloration au bleu de toluidine (TB) 28 jours et 56 jours après tMCAO, nous avons constaté que seules les combinaisons His 1000–200 et 1000–500 réduisaient remarquablement la zone d'infarctus (Fig. 2A, C : n = 10–12 ; Fig. .2E : n = 6–7). La zone de cicatrice gliale autour du noyau de l'infarctus a été quantifiée à partir de la coloration histochimique GFAP diaminobenzidine. Seul le traitement avec His 1000–500 a réduit de manière robuste la zone de cicatrice gliale 28 jours et 56 jours après ischémie (Fig. 2B,D : n = 10–12 ; Fig. 2F : n = 6–7). Aucun changement statistiquement significatif de la zone de cicatrice gliale n'a été détectable entre le tMCAO et les autres groupes de traitement à l'histidine. Prises ensemble, ces données démontrent que l'histidine fournit une neuroprotection à long terme après une ischémie cérébrale et que le traitement His 1000–500 a affiché la protection la plus robuste sur la fonction neurologique et la réduction de la formation de cicatrices gliales.

L'histidine réduit la zone d'infarctus et la zone de cicatrice gliale après une ischémie cérébrale focale.

Sous les différents régimes de traitement à l'histidine, la zone d'infarctus a été estimée avec une coloration TB sur 28 jours (C) et 56 jours (E) après tMCAO, avec la couche représentative indiquée en (A). La zone de cicatrice gliale a également été estimée avec une coloration GFAP sur 28 jours (D) et 56 jours (F) après tMCAO, avec la photo représentative montrée en (B) (B1 montre la zone quantifiée ; B2-B5 montre le bord élargi de la cicatrice gliale ). n = 10–12 pour C et D ; n = 6–7 pour E et F. B1 : barre = 500 μm ; B2–5 : barre = 100 μm. *P < 0,05, ***P < 0,001, par rapport au groupe tMCAO.

La formation de cicatrice gliale résulte généralement de changements morphologiques et fonctionnels des astrocytes qui incluent l'activation avec la régulation positive de GFAP, la prolifération, ainsi que la migration vers le bord de la lésion21,22, ainsi la réduction de la zone de cicatrice gliale par l'histidine peut éventuellement être liée à ces aspects. Pour tester cette hypothèse, l'activation des astrocytes au niveau de la zone de pénombre a été examinée par immunohistochimie et Western blot. Après une ischémie cérébrale, les astrocytes ont été activés de manière frappante avec une expression accrue de GFAP, mais le traitement de His 1000 n'a eu aucun effet supplémentaire sur l'activation des astrocytes 7 jours après l'ischémie, pas plus que les traitements His 1000-0 et 1000-500 14 jours après ischémie (Supplément Fig. 2 ; n = 6–7). Par la suite, la prolifération des astrocytes a été évaluée sur la base de la quantification des cellules BrdU+/GFAP+ au niveau de la zone de pénombre. Bien que le nombre de cellules BrdU + ait augmenté après le traitement His 1000–500, le nombre de cellules BrdU + / GFAP + est resté inchangé (supplément Fig. 3; n = 6–7), ce qui indique que l'histidine n'a aucun effet sur la prolifération des astrocytes. Le test de cicatrisation des astrocytes en culture nous permet d'analyser l'action directe de l'histamine sur l'activation, la prolifération et la migration des astrocytes. L'expression de GFAP et le nombre de cellules BrdU + étaient inchangés à la limite de la plaie après le traitement à l'histamine (supplément Fig. 4). Par conséquent, la régulation de l'activation et de la prolifération des astrocytes a peu contribué à la réduction de la zone de cicatrice gliale par l'histidine.

Pour déterminer si l'action de l'histidine sur la migration des astrocytes est attribuée à la réduction de la zone de cicatrice gliale, la distribution des astrocytes a été quantifiée en mesurant la zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs. 7 jours après l'ischémie, il n'y avait aucune différence de taille de la zone d'infarctus entre le groupe témoin et le groupe His 1000, tandis que 14 jours après l'ischémie, la zone de l'infarctus était considérablement réduite dans le groupe His 1000-500 par rapport aux témoins (33,7 ± 2,1 % vs. 49, 0 ± 2, 3%, P <0, 001; Fig. 3A, B; n = 6–8), ce qui suggère que l'histidine facilite la migration des astrocytes vers le noyau de l'infarctus au stade tardif du traitement après une ischémie cérébrale. Le fait que la surface de l'infarctus à 14 jours soit restée inchangée dans le groupe His 1000–0 par rapport aux témoins suggère que le traitement à l'histidine au stade tardif était indispensable à la migration des astrocytes vers le cœur de l'infarctus (43,7 ± 2,7 % contre 49,0 ± 2,3 % ; Fig. 3A, B ; n = 6–8), ce qui pourrait entraîner une formation de cicatrice plus fine par la suite (Fig. 2B, D, F).

L'histidine favorise la migration réactive des astrocytes vers le cœur de l'infarctus.

L'immunocoloration GFAP a été réalisée 7 jours et 14 jours après tMCAO (A) et la zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs a été quantifiée (B). La morphologie des astrocytes du bord de la cicatrice gliale indiquée par des flèches en A a été montrée en C1–3, avec des images agrandies en C4–6 (GFAP : vert ; DAPI : bleu). Les flèches en C4–6 indiquent les astrocytes polarisés. La longueur (D), la largeur (E), le rapport longueur/largeur des saillies (F) et le pourcentage d'astrocytes polarisés (G) ont été quantifiés au bord de la cicatrice gliale 14 jours après tMCAO. n = 6–8. A : barre = 1 mm ; C1–3 : barre = 100 μm ; C4–6 : barre = 50 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, par rapport au groupe tMCAO, #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, par rapport au groupe His 1000–0.

La migration cellulaire est un processus en plusieurs étapes hautement orchestré. Pour migrer, une cellule acquiert d'abord une morphologie polarisée caractéristique en réponse à des signaux extracellulaires, caractérisée par une saillie allongée19. Nous avons analysé la morphologie des astrocytes au bord de la cicatrice gliale (Fig. 3C–G ; n = 6–8) et avons constaté que le traitement His 1000–500 mais pas His 1000–0 augmentait significativement la longueur relative de (1,36 ± 0,10 vs 1,00 ± 0,03 ; P < 0,01), mais réduit la largeur relative des saillies des astrocytes (0,66 ± 0,05 vs 1,00 ± 0,05 ; P < 0,01) et augmente ainsi le rapport longueur/largeur (2,22 ± 0,34 vs 1,00 ± 0,04 ; P < 0,01). De plus, le pourcentage de cellules polarisées avec le critère selon lequel la longueur de la saillie dépassait la largeur d'au moins quatre fois, a augmenté dans le groupe de traitement His 1000–500 (40, 1 ± 2, 7 contre 21, 9 ± 2, 4; P <0, 001).

Pour confirmer l'effet de l'histamine sur la migration des astrocytes, la distance de migration a été évaluée par un test de cicatrisation (Fig. 4A, B; à partir de 3 à 4 expériences indépendantes). L'histamine a considérablement stimulé la migration des astrocytes à la limite de la plaie, la dose de 10−7 mol/L montrant l'effet maximal (1,86 ± 0,10 contre 1,00 ± 0,06 ; P < 0,001). Dans le test de migration transwell qui est un autre test courant pour la réponse migratoire cellulaire, encore une fois, nous avons constaté qu'il y avait plus de cellules migrées après l'administration d'histamine (Fig. 4D, F; à partir de 3 à 4 expériences indépendantes). L'histamine 10−7 mol/L a affiché la promotion maximale sur la migration des astrocytes (1,67 ± 0,03 contre 1,00 ± 0,10 ; P < 0,001), alors que cet effet était réduit avec l'augmentation de la dose.

L'histamine favorise la migration des astrocytes dans le test de cicatrisation et le test de migration transwell in vitro.

Les micrographies en contraste de phase montrent la migration des astrocytes sous le traitement de l'histamine (HA) 10−7 mol/L à 0 h, 24 h et 48 h après le scratch (A, les lignes blanches indiquent les bords de la plaie). La distance de migration a été quantifiée sous les différentes concentrations d'histamine à 24 h après le scratch (B). L'effet de l'histamine sur la migration des astrocytes a également été analysé dans le test de migration transwell (F), avec des images représentatives des astrocytes migrés sous le traitement de l'histamine 10-7 mol/L (D). Les cellules avec des lamellipodes à la limite de la plaie ont été comptées 2 h ou 4 h après l'égratignure sous le traitement de 10−7 mol/L d'histamine (G), avec des images représentatives colorées avec de la rhodamine-phalloïdine pour montrer la F-actine (C, les flèches indiquent les cellules à lamellipodes). A 24h après le scratch, les cellules sous traitement à l'histamine 10-7 mol/L ont été colorées au GFAP en vert et au DAPI en bleu. La morphologie des astrocytes à la limite de la plaie a été analysée, y compris la longueur (H), la largeur (I), le rapport longueur/largeur des saillies (J) et le pourcentage d'astrocytes polarisés (K), avec les images représentatives montrées dans (E). Le pourcentage d'astrocytes adhérant à la poly-L-lysine et à la laminine 30 min après le placage a été quantifié en L. Les valeurs sont de 3 à 4 expériences indépendantes. C : barre = 50 µm ; D, E : barre = 100 µm. *P < 0,05, **P < 0,01,***P < 0,001, par rapport au groupe témoin (CON).

Au niveau du front cellulaire, l'assemblage de l'actine entraîne l'extension de protubérances membranaires plates appelées lamellipodes, ce qui contribue à la polarisation cellulaire pour la migration23. Comme le montre une coloration de l'actine filamenteuse (actine F), l'histamine a augmenté le pourcentage de cellules avec des lamellipodes à la limite de la plaie (Fig. 4C, G). Nous avons ensuite examiné la morphologie des astrocytes à la limite de la plaie par immunocoloration GFAP. Comme le montre la Fig. 4E, H – K (à partir de 3 à 4 expériences indépendantes), similaire à celle in vivo, l'histamine a remarquablement augmenté la longueur relative des saillies (1, 38 ± 0, 02 contre 1, 00 ± 0, 02; P <0, 001), rapport de longueur à largeur des saillies (1,85 ± 0,06 vs 1,00 ± 0,04 ; P < 0,001), pourcentage de cellules polarisées (77,5 ± 3,3 vs 31,9 ± 2,5 ; P < 0,001), mais réduit la largeur relative des saillies (0,75 ± 0,02 contre 1,00 ± 0,04 ; P < 0,001). Suite à la polarisation, les cellules forment des adhérences qui relient la matrice extracellulaire au cytosquelette d'actine pour ancrer la saillie et tracter le corps cellulaire, donc l'altération de l'adhérence pourrait également influencer la migration24. Cependant, notre étude a indiqué que la capacité d'adhésion des astrocytes était inchangée après le traitement à l'histamine, qui a été testé sur une surface revêtue de poly-L-lysine ou de laminine (Fig. 4L). Ensemble, ces résultats suggèrent que l'histamine facilite la migration des astrocytes vers le noyau de l'infarctus, probablement en favorisant la polarisation des astrocytes.

Les récepteurs H1 et H2 de l'histamine ont été trouvés dans les astrocytes25,26, alors que leurs fonctions exactes sont largement inconnues. Nous avons constaté que l'amthamine agoniste H2 avait une action similaire à celle de l'histamine sur la migration des astrocytes dans le test de cicatrisation des plaies, tandis que l'antagoniste H2 cimétidine et la famotidine annulaient tous deux l'effet promotionnel de l'histamine sur la migration des astrocytes (Fig. 5A; à partir de 3 à 4 expériences indépendantes). D'autre part, la pyrilamine antagoniste H1 ne peut pas inhiber l'action susmentionnée de l'histamine (Supplément Fig. 5). La PKA se trouve dans la voie du signal en aval de l'activation du récepteur de l'histamine H227. Nous avons découvert que l'inhibiteur de la PKA Rp-AMPc inversait également la migration des astrocytes favorisée par l'histamine (Fig. 5A; à partir de 3 à 4 expériences indépendantes), ce qui confirmait davantage l'implication du récepteur H2 dans l'action de l'histamine sur la migration des astrocytes. De plus, l'administration de cimétidine, de famotidine, de pyrilamine et de Rp-AMPc seuls n'a eu aucun effet sur la migration des astrocytes.

L'histidine favorise la migration des astrocytes et fournit une neuroprotection par le récepteur H2.

Dans le test de cicatrisation, la cimétidine (Cime) à 10−7 mol/L, la famotidine (Famo) à 10−7 mol/L ou le Rp-AMPc à 10−5 mol/L ont été administrés après le scratch, tandis que 10− 7 mol/L d'histamine (HA) ou 10-8 mol/L d'amthamine (Amth) ont été ajoutés 30 min plus tard. Leurs effets sur la migration des astrocytes ont été montrés en (A). Les traitements à la cimétidine ont également été divisés en deux phases (première semaine et semaine suivante), au cours desquelles la cimétidine n'a pas été administrée ou administrée à la dose de 20 ou 100 mg/kg à 30 min avant chaque injection d'histidine, y compris Cime 20-20, Cime régimes 100–100, Cime 0–100 et Cime 100–0. La morphologie des astrocytes du bord de la cicatrice gliale 14 jours après tMCAO a été montrée en B (GFAP : vert ; DAPI : bleu). La longueur (C), la largeur (D), le rapport longueur/largeur des saillies (E) et le pourcentage d'astrocytes polarisants (F) ont été quantifiés. La zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs a été quantifiée en (G). Le score de déficit neurologique a été évalué à 1 j, 3 j, 7 j et 14 j après tMCAO (H), tandis que la zone de l'infarctus a également été estimée avec une coloration TB (I). A : les valeurs sont de 3 à 4 expériences indépendantes ; B–I : n = 10–12. Barre = 50 µm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, par rapport au groupe témoin (A) ou au groupe tMCAO (C–I) au cours de chaque journée de test ou de chaque test ; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, par rapport à l'histamine ou au groupe His 1000–500 au cours de chaque journée de test ou de chaque test.

Pour vérifier l'implication du récepteur H2 dans les actions de l'histidine in vivo, de la cimétidine a été injectée avant chaque traitement à l'histidine (Fig. 5B – I). Nous avons constaté que la polarisation des astrocytes au bord de la cicatrice gliale était également atténuée par l'injection de cimétidine (100 mg / kg) pendant 0 à 14 jours ou 7 à 14 jours (appelées combinaisons Cime 100-100 ou Cime 0-100, respectivement) , qui se manifestait par la longueur raccourcie des protubérances et le pourcentage réduit de cellules polarisées mais une largeur de protrusion accrue, par rapport au traitement avec His 1000–500 seul (Fig. 5B–F ; n = 10–12). La réduction de la zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs après le traitement His 1000–500 a également été abrogée par l'injection de cimétidine (100 mg / kg) pendant 0–14 jours ou 7–14 jours après l'ischémie (Fig. 5G; n = 10–12 ). Cependant, le traitement à la cimétidine pendant 0 à 7 jours (100 mg / kg, référé au traitement combiné Cime 100–0) n'a pas eu un tel effet, ce qui suggère que le blocage du récepteur H2, en particulier au stade tardif, a inversé la promotion de la migration des astrocytes par l'histidine. .

Le score de déficit neurologique et la zone de l'infarctus ont également été évalués après l'injection de cimétidine (Fig. 5H, I ; n = 10–12). Encore une fois, l'injection de cimétidine (100 mg/kg) pendant 0-14 jours ou 7-14 jours, mais pas 0-7 jours, a inversé la réduction induite par l'histidine du score de déficit neurologique évalué 14 jours après l'ischémie cérébrale, lorsque la migration des astrocytes a également eu lieu (Fig. 5H ; n = 10–12). En parallèle, la réduction de la surface de l'infarctus apportée par l'histidine a été abrogée par la cimétidine (100 mg/kg) injectée pendant 0–14 j ou 7–14 j (Fig. 5I ; n = 10–12). En revanche, la pyrilamine, antagoniste des récepteurs H1, n'a aucun effet sur l'action de l'histidine sur la polarisation des astrocytes (Supplément Fig. 5). Ces données indiquent que l'effet promotionnel de l'histamine sur la migration des astrocytes est médié par le récepteur H2, qui peut contribuer à son effet neuroprotecteur.

De nombreuses études ont révélé que les Rho GTPases, dont RhoA, Rac1 et CDC42, sont cruciales pour les voies de signalisation sous-jacentes à l'établissement de la polarisation qui précède la migration cellulaire, parmi lesquelles Rac1 serait le principal activateur de la formation des lamellipodes23. Nous avons constaté que l'histamine augmentait le niveau de Rac1 actif, tel qu'examiné par le test pull-down GTPase qui teste Rac1 lié au GTP, tandis que la cimétidine et le Rp-AMPc supprimaient tous deux la régulation à la hausse de Rac1 par l'histamine (Fig. 6A; de 3 à 4 expériences indépendantes). De plus, l'inhibiteur de Rac1 NSC23766 a inversé la promotion induite par l'histamine de la migration des astrocytes (Fig. 6B; à partir de 3 à 4 expériences indépendantes), ce qui suggère que l'histamine peut faciliter la migration des astrocytes via le récepteur H2 et la régulation ultérieure de Rac1 actif.

L'inhibition de la petite GTPase Rac1 empêche la migration des astrocytes et la récupération neurologique fournie par l'histidine.

Dans le test de cicatrisation, la cimétidine (Cime, 10−7 mol/L) ou Rp-cAMP (10−5 mol/L), l'inhibiteur Rac1 NSC 23766 à la concentration indiquée ont été administrés après le scratch, tandis que 10−7 mol/L l'histamine (HA) a été ajoutée 30 minutes plus tard. La petite GTPase Rac1 liée au GTP a été examinée par analyse Western blot 24 h après le scratch (A). La quantification de la distance de migration à 24 h après le scratch a été montrée en B. Après tMCAO, 50 μg de NSC23766 ont été délivrés dans le ventricule cérébral 30 min avant chaque injection d'histidine de 7 j à 14 j après tMCAO. Ses effets sur la zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs et sur la morphologie des astrocytes au bord de la cicatrice gliale 14 jours après tMCAO ont été montrés en (C, D) avec immunomarquage GFAP (GFAP : vert ; DAPI : bleu). La longueur (E), la largeur (F), le rapport longueur sur largeur des saillies (G) et le pourcentage d'astrocytes polarisés (H) ont été quantifiés. Le score de déficit neurologique (I) a été évalué à 1 jour, 3 jours, 7 jours, 14 jours et 28 jours après tMCAO, tandis que les capacités cognitives ont été évaluées par le test de conditionnement contextuel et indicé de la peur (jour 27, J) et le labyrinthe aquatique de Morris. (Jour 22-24, K) avec des parcours de nage représentatifs (Jour 24, le cercle gris indique l'emplacement de la plate-forme). La zone de cicatrice gliale (L) et la zone d'infarctus (M) de la coloration TB ont été déterminées 28 jours après tMCAO. A et B : les valeurs sont de 3 à 4 expériences indépendantes ; C–L : n = 10–12. D : barre = 50 µm ; L : barre = 100 µm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, par rapport au groupe témoin (A,B) ou au groupe fictif (J,K) au cours de chaque jour de test ou de chaque test ; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, par rapport au groupe de traitement à l'histamine A et B) ou au groupe tMCAO (C–M) ; &P < 0,05, &&P < 0,01, &&&P < 0,001, par rapport au groupe His 1000–500 au cours de chaque jour de test ou de chaque test.

Pour vérifier davantage l'implication de la migration des astrocytes dans l'effet protecteur de l'histidine, l'inhibiteur de Rac1 NSC23766 a été délivré dans le ventricule cérébral pendant 7 à 14 jours après tMCAO, période pendant laquelle les astrocytes ont migré vers le noyau de l'infarctus (Fig. 3A, B). La zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs a été agrandie après l'administration de NSC23766 avec un traitement à l'histidine (Fig. 6C ; n = 10–12). La polarisation des astrocytes a également été abrogée par NSC23766, comme en témoignent les augmentations de la longueur, le rapport longueur / largeur des saillies et le pourcentage de cellules polarisantes, mais la diminution de la largeur de la saillie (Fig. 6D – H; n = 10–12), ce qui suggère que NSC23766 peut inhiber la migration des astrocytes régulée positivement par l'histidine. NSC23766 a également inversé l'amélioration de la fonction neurologique induite par l'histidine après une ischémie cérébrale (Fig. 6I; n = 10–12). Dans le test de conditionnement de la peur et le test du labyrinthe aquatique de Morris, NSC23766 a inversé de manière robuste l'amélioration des capacités cognitives conférée par l'histidine (Fig. 6J, K; n = 10–12). De plus, NSC23766 a abrogé la réduction induite par l'histidine de la zone de cicatrice gliale (Fig. 6L ; n = 10–12 ; 0,58 ± 0,03 contre 0,39 ± 0,03 ; P <0,001) et la zone d'infarctus comme indiqué par la coloration TB (Fig. 6M ; n = 10–12 ; 38,9 ± 4,2 contre 27,5 ± 2,4 ; P < 0,05). Ensemble, ces résultats suggèrent que la migration des astrocytes est cruciale pour l'effet neuroprotecteur de l'histidine après une ischémie cérébrale.

Il a été rapporté que l'histamine offrait une neuroprotection à un stade précoce après une ischémie cérébrale, ce qui est attribué à son action sur les neurones, les astrocytes ou les cellules inflammatoires28. L'histidine et son précurseur carnosine ont également une neuroprotection directe à un stade très précoce après le début de l'ischémie cérébrale avec leurs propriétés antioxydantes et anti-apoptotique. Cependant, l'action de l'histamine ou de ses agents apparentés à un stade tardif après une ischémie cérébrale n'a pas été étudiée. Ici, grâce à des évaluations comportementales et pathologiques, nous avons constaté que l'histidine, qui est le précurseur de l'histamine, fournissait une neuroprotection à long terme de manière dépendante de la dose et du stade. Cette protection peut être largement due à la restriction de la formation de cicatrices gliales en favorisant la migration des astrocytes. Notre étude met en évidence la régulation de la fonction des astrocytes comme stratégie thérapeutique pour les lésions cérébrales induites par l'ischémie cérébrale.

Le régime dépendant de la dose et du stade du traitement à l'histidine a été proposé sur la base des résultats des tests comportementaux, de l'examen pathologique et de l'expérience in vitro (Figs 1, 2 et 4), comme suit : 1) l'histidine à une dose constante de 1 000 mg/kg a amélioration de la fonction neurologique, qui n'est néanmoins pas aussi remarquable que le traitement avec un régime dépendant de la dose et du stade ; 2) l'histidine (1000 mg/kg) au stade précoce uniquement (fait référence au groupe His 1000–0) n'a aucun effet protecteur sur le déficit neurologique et la mémoire de la peur au stade tardif ; 3) l'histidine à une dose élevée de 1 000 mg/kg au stade précoce et à une faible dose de 200 ou 500 mg/kg au stade tardif a produit une protection supérieure concernant la fonction neurologique et la zone de l'infarctus, parmi lesquelles le régime avec une dose de 500 mg/kg à le stade tardif a l'effet protecteur le plus important, alors qu'un régime avec une séquence de dose inversée avec une faible dose au stade précoce mais une dose élevée au stade tardif n'a aucune protection (données non présentées) ; 4) seul le traitement avec His 1000–500 a réduit la zone cicatricielle gliale ; 5) la promotion de la migration des astrocytes in vitro diminue à mesure que la dose d'histamine augmente, ce qui suggère qu'une dose élevée d'histamine peut ne pas bénéficier à la migration des astrocytes qui a lieu au stade tardif. Par conséquent, notre étude a suggéré que la stratégie de traitement dépendante de la dose et du stade est efficace pour le traitement de l'ischémie cérébrale.

Les facteurs sous-jacents contribuant à l'effet protecteur de ce régime dépendant de la dose et du stade peuvent être complexes, probablement en raison des multiples actions impliquées contre les lésions cérébrales induites par l'ischémie cérébrale. L'histidine à une dose de 1000 mg/kg administrée au stade précoce après le début de l'ischémie réduit le volume de l'infarctus et la mort neuronale et ses actions sur la survie neuronale, la clairance astrocytaire du glutamate et l'inhibition de l'infiltration des cellules inflammatoires sont suggérées comme étant les mécanismes sous-jacents11,28. Ces événements aigus ou subaigus surviennent généralement quelques jours ou une semaine après l'ischémie lorsque le sauvetage des astrocytes à ce stade joue souvent un rôle bénéfique, alors que les astrocytes forment progressivement une barrière ferme pour empêcher la reconstruction neuronale par la suite. Bien qu'un schéma thérapeutique strict basé sur l'évolution dans le temps n'ait pas été étudié, dans le cadre du schéma actuel combiné à haute et faible dose, l'histidine a remarquablement réduit la formation de barrière cicatricielle gliale, ce qui peut sous-tendre sa protection à long terme contre les déficiences comportementales et l'infarctus. Par conséquent, le système histaminergique peut probablement être une cible thérapeutique prometteuse en orchestrant les actions des astrocytes après une ischémie cérébrale de manière dépendante de la dose et du stade.

De plus, notre étude a indiqué que l'histidine ou l'histamine n'affectaient pas la prolifération et l'activation (Supplément Figs 2-4), mais seulement la migration des astrocytes (Fig. 3), ce qui entraînait une barrière cicatricielle gliale plus fine (Figs 2B, D ,F et 6L). De plus, nous avons constaté que la promotion de la migration des astrocytes contribuait à la protection, comme en témoigne le fait que le blocage de la migration des astrocytes par NSC23766 supprimait la neuroprotection induite par l'histidine (Fig. 6). D'autres études ont également suggéré la contribution de la migration des astrocytes à la neuroprotection. Dans les lésions de la moelle épinière, un effet bénéfique a été observé après la stimulation des astrocytes en migration par inhibition de la glycogène synthase kinase-331. De plus, l'adrénomédulline fournit une neuroprotection contre les lésions induites par l'ischémie cérébrale tout en améliorant la migration des astrocytes32. À noter, cette migration est souvent désignée par un déplacement ou un déplacement des astrocytes vers le noyau de l'infarctus, qui peut être différent de la migration des astrocytes pour former une cicatrice gliale, dans laquelle les astrocytes s'accumulent dans la zone de pénombre.

Une préoccupation directe concernant les avantages de la migration des astrocytes peut être qu'elle conduit à une cicatrice gliale compactée pour former une barrière plus fine (Figs 2B, D, F et 6L) et génère une plus grande zone de pénombre sans cicatrice gliale (Figs 3A, B et 6C ), afin de favoriser la neurogenèse dans la zone de pénombre. Cette notion est plausible puisque davantage de neurones nouveau-nés ont été trouvés au bord de la cicatrice gliale après le traitement à l'histidine, qui a été abrogé par l'inhibiteur de Rac1 NSC 23766 ainsi que le blocage de la migration des astrocytes (Supplément Fig. 6). En outre, les astrocytes migrés peuvent resserrer les cellules inflammatoires dans le noyau de l'infarctus, ce qui a été confirmé dans les lésions de la moelle épinière31. De plus, il convient de noter que le contrôle de la formation de cicatrices gliales via la manipulation de la migration des astrocytes peut être une approche supérieure pour produire une neuroprotection, car d'autres moyens d'obtenir moins de formation de cicatrices gliales, tels que l'inhibition de l'activation et de la prolifération des astrocytes, peuvent affecter le fonctionnement normal des astrocytes et provoquer l'extension de la zone lésée au stade précoce de l'ischémie. En effet, l'ablation de l'activation des astrocytes à l'aide de souris à double knock-out d'astrocytes GFAP et de vimentine a augmenté le volume de l'infarctus, ce qui peut être lié aux modifications du transport du glutamate, des jonctions lacunaires et de l'expression de l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène-1 dans les astrocytes33.

La migration des astrocytes est médiée par les récepteurs H2, comme indiqué dans notre enquête avec l'application d'un antagoniste et d'un agoniste du récepteur H2 et par le blocage de sa voie de signalisation in vitro (Fig. 5). De plus, l'antagoniste H2, mais pas l'antagoniste H1, a également inhibé la migration des astrocytes et inversé la réduction induite par l'histidine de la zone d'infarctus. A noter que pendant toute la durée du traitement avec l'antagoniste H2, des effets similaires à celui décrit ci-dessus n'ont été observés qu'au stade tardif après l'ischémie cérébrale, période pendant laquelle la migration des astrocytes se développe. Ainsi, l'activation du récepteur H2 dans les astrocytes facilite la migration des astrocytes vers la zone de l'infarctus conférant une neuroprotection au moins au stade tardif après l'ischémie cérébrale, alors que le récepteur H1 n'est probablement pas impliqué (Supplément Fig. 5).

La multitude d'actions de l'histamine après une ischémie cérébrale peut reposer en grande partie sur la participation de ses multiples récepteurs tels que les récepteurs H1 et H2, qui affectent différentes cellules via différentes actions12,28,34,35. Notre étude a révélé un nouvel effet de l'histamine sur la migration des astrocytes à travers le récepteur H2 pour fournir une neuroprotection à long terme. De plus, un effet direct de l'histidine sur les troubles cognitifs après une ischémie cérébrale ne peut être exclu, car il a été démontré que l'histamine améliore l'apprentissage et la mémoire36,37,38. L'administration d'histamine dans l'hippocampe améliore les déficits de mémoire spatiale dans la tâche de labyrinthe à bras radial via les récepteurs H1 et H236. Les injections bilatérales post-entraînement des agonistes des récepteurs H2 amthamine ou RAMH dans l'hippocampe dorsal facilitent la consolidation de la mémoire après un conditionnement contextuel de la peur37. Ainsi, l'histamine ou ses agents apparentés peuvent être des candidats potentiels pour la récupération fonctionnelle au cours de la lésion d'ischémie cérébrale à long terme.

Les Rho GTPases jouent un rôle central dans la migration cellulaire, parmi lesquelles la formation de lamellipodes induite par Rac138. Un rapport élevé d'astrocytes polarisés et de formation de lamellipodes a été observé dans les astrocytes en culture traités à l'histamine ou dans le bord de la cicatrice gliale dans les tissus de rats traités à l'histidine. De plus, la petite GTPase Rac1 active liée au GTP était régulée positivement par l'histamine, qui peut être inversée par la cimétidine ou le Rp-AMPc. NSC 23766, un inhibiteur spécifique de Rac1 a abrogé la promotion induite par l'histamine de la migration des astrocytes. Par conséquent, l'histamine favorise la migration des astrocytes vers la zone de l'infarctus via le récepteur H2 et l'activation ultérieure de Rac1, ce qui enrichit nos connaissances sur le rôle de l'histamine dans la migration des astrocytes dans le SNC.

En conclusion, nos données indiquent qu'un traitement dépendant de la dose et du stade avec l'histidine favorise la migration des astrocytes vers la zone de l'infarctus via le récepteur H2 et la régulation ultérieure de Rac1 actif, ce qui profite à la récupération de la fonction neurologique à long terme après une ischémie cérébrale. Cela suggère également que le ciblage du système histaminergique peut être une nouvelle stratégie thérapeutique pour les lésions induites par l'ischémie cérébrale à long terme par ses actions sur les astrocytes.

Les rats mâles Sprague-Dawley (SD) pesant 250 à 280 ont été utilisés pour des expériences in vivo et les rats néonatals SD ont été utilisés pour des expériences de cultures d'astrocytes. Toutes les expériences ont été approuvées et menées conformément aux directives éthiques du Comité d'expérimentation animale de l'Université du Zhejiang et étaient en totale conformité avec le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Des efforts ont été faits pour minimiser toute douleur ou inconfort et le nombre minimum d'animaux a été utilisé. Dans toutes les expériences suivantes, les animaux ont été randomisés en groupes de contrôle et de traitement.

Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale d'hydrate de choral (350 mg/kg). L'ischémie cérébrale focale transitoire a été induite par la tMCAO, comme décrit précédemment39. En bref, une suture en monofilament de nylon 6–0, émoussée à l'extrémité et enduite de 1% de poly-L-lysine, a été avancée de 18 mm dans la carotide interne pour occlure l'origine de l'artère cérébrale moyenne (MCA). Le débit sanguin cérébral (CBF) dans le territoire de l'artère cérébrale moyenne a été déterminé par débitmétrie laser Doppler40 (Periflux System 5010; Perimed, Jarfalla, Suède). Une sonde à fibre optique flexible a été fixée au crâne sur le cortex alimenté par la partie proximale du MCA droit (2 mm caudale au bregma et 6 mm latéralement à la ligne médiane). Les animaux avec une réduction <80 % du CBF dans le cœur du territoire de la MCA ont été exclus de l'étude. Après 90 min d'occlusion, la reperfusion a été réalisée en retirant le monofilament. Les rats, dont le DSC post-reperfusion n'atteint pas 60 % du DSC précédent avant occlusion, ont été exclus. La température corporelle a été maintenue à 37 ° C par une lampe chauffante (FHC, Bowdoinham) pendant la chirurgie et pendant 2 h après le début de la reperfusion.

Il y avait 4 expériences distinctes. Au sein de chacun, les rats ont été randomisés dans le groupe de traitement comme suit (supplément Fig. 7). Expérience 1, les rats ont reçu 200, 500 ou 1000 mg/kg d'histidine pendant la première semaine. Expérience 2, les rats ont reçu 1000 mg/kg d'histidine au cours de la première semaine mais 0, 200, 500 ou 1000 mg/kg d'histidine au cours des semaines suivantes, qui sont nommés His 1000–0, His 1000–200, His 1000–500 ou Ses 1000 à 1000 groupes. Pour le traitement à l'histidine, l'histidine (Sigma, USA) a été dissoute dans une solution saline normale et injectée par voie intrapéritonéale à 0 h, 6 h et tous les deux jours après tMCAO. Pour les contrôles, les rats ont été injectés avec le même volume de solution saline. Expérience 3, avec le traitement His 1000–500, les traitements à la cimétidine ont également été divisés en deux phases (première semaine et semaine suivante), au cours desquelles de la cimétidine (20 ou 100 mg/kg) a été administrée par voie intrapéritonéale 30 min avant chaque injection d'histidine, y compris Régimes Cime 20–20, Cime 100–100, Cime 0–100 et Cime 100–0. Expérience 4, avec le traitement His 1000–500, l'inhibiteur de Rac1 NSC 23766 (50 μg) a été administré au ventricule controlatéral 30 min avant chaque injection d'histidine au cours de la deuxième semaine après la tMCAO. La fonction neurologique a été notée à 1, 3, 7, 14, 28, 42, 56 jours après tMCAO39 et les capacités cognitives dans le labyrinthe aquatique de Morris (jour 22-25, jour 50-53) et le conditionnement contextuel de la peur (jour 26-27, Jour 54-55) ont été évalués avant le sacrifice41,42,43. Les rats ont été sacrifiés à 7, 14, 28 ou 56 jours après tMCAO pour immunohistochimie, Western blot ou coloration TB. Le nombre d'animaux d'inclusion et d'exclusion pour chaque groupe est indiqué dans le tableau supplémentaire 1.

Des cultures primaires d'astrocytes corticaux ont été préparées à partir de rats SD postnatals de 1 à 2 jours, comme décrit précédemment44. Des rayures ont été faites sur la couche cellulaire en utilisant une pointe de pipette stérile de 20 ul. Les plaques ont ensuite été rincées avec du PBS stérile pour éliminer les débris cellulaires et remplacées par du milieu de culture cellulaire frais additionné de 1 % de sérum bovin fœtal (FBS). De la cimétidine, du Rp-AMPc ou du NSC23766 à la concentration indiquée ont été ajoutés au remplacement du milieu, tandis que l'histamine a été ajoutée 30 min plus tard. À 0, 24 et 48 h après le scratch, les cellules ont été colorées avec du GFAP ou observées au microscope à contraste de phase (Olympus, Japon). La distance entre les deux bords de la rayure a été déterminée en mesurant la surface de la plaie divisée par la longueur de la rayure à l'aide du logiciel NIH Image J. Pour l'analyse des petites GTPases, des échantillons de protéines cellulaires ont été préparés 2 h après le scratch.

Pour l'immunohistochimie, les rats ont été anesthésiés avec de l'hydrate de choral (350 mg/kg) et perfusés par voie transcardiaque avec une solution saline normale glacée et du paraformaldéhyde à 4 %. Les cerveaux ont été prélevés et post-fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 24 h, puis dans du saccharose à 30 % dans du PBS pendant 3 jours. Des coupes de cerveau congelées ont été coupées à 10 μm sur un cryostat (Leica, Allemagne). Pour l'immunocytochimie, la monocouche d'astrocytes a été fixée dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min. Les astrocytes cultivés ou les coupes de cerveau ont ensuite été incubés avec du sérum d'âne normal à 3 % dans du PBS contenant 0,1 % ou 0,3 % de Triton X-100 pendant 15 min, respectivement. Ensuite, l'anticorps primaire pour GFAP (1: 400, Boster, Chine) a été appliqué pour une incubation d'une nuit à 4 ° C. Après plusieurs lavages dans du PBS, une IgG anti-lapin conjuguée Alexa 488 (1: 400; Invitrogen, États-Unis) a été appliquée pendant 2 h d'incubation à température ambiante. Pour la coloration de la F-actine, les cellules ont été incubées dans de la rhodamine-phalloïdine (1: 500, Invitrogen, USA) pendant 30 min au lieu de l'incubation d'anticorps. Après des lavages répétés, les coupes ou les astrocytes en culture ont été montés dans un milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:1000 ; Sigma, USA). Enfin, les images ont été prises sous un microscope à fluorescence (Olympus BX51 ; Japon). Pour la quantification des cicatrices gliales, une coloration histochimique à la diaminobenzidine a été réalisée. Les peroxydases endogènes ont été désactivées par traitement avec 3 % de H2O2 dans du méthanol et les lames ont été bloquées avec 10 % de sérum de chèvre normal. Les lames ont ensuite été colorées avec un anticorps pour GFAP (1: 200, Boster, Chine) et ont été traitées par le kit Histostain-Plus IHC (MR Biotech, Chine). Ensuite, les coupes ont été montées après avoir été lavées trois fois pendant 10 min avec du PBS. La mesure de la zone de la cicatrice gliale, le comptage des cellules et l'analyse de la morphologie ont été effectués par les logiciels Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, USA) et Image J (NIH, Bethesda, MD). La longueur des saillies a été déterminée comme la distance entre l'arrière du noyau et la pointe des saillies. La largeur a été déterminée au bas des protubérances. Les cellules polarisées ont été notées lorsque la longueur de la saillie dépassait la largeur de la saillie au moins quatre fois45. Au total, environ 500 astrocytes de la zone de cicatrice gliale de 3 tranches ont été examinés pour chaque animal.

Pour quantifier la zone d'infarctus, des coupes cérébrales coronales en série ont été coupées à 30 μm sur un cryostat (Leica, Allemagne) et collectées tous les 1, 5 mm dans tout le cerveau. Les tranches ont été colorées avec 1% TB pour définir le tissu non infarctus. Le pourcentage de la surface de l'infarctus a été calculé comme 100 fois le rapport de la surface de l'infarctus à la surface totale de l'hémisphère controlatéral. La zone d'infarctus entourée d'astrocytes réactifs a également été estimée après l'immunocoloration GFAP par les mêmes moyens.

Les astrocytes cultivés ont été homogénéisés dans un réactif d'extraction de protéines. Les Rac1 actifs liés au GTP ont été isolés avec le kit GTPase Pull-Down (Thermo, USA). Les échantillons de protéines ont ensuite été séparés sur des gels de SDS-polyacrylamide à 12,5 % puis électrotransférés sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage avec du lait écrémé à 5 %, les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires contre rac 1 (1 : 500 ; Millipore, États-Unis) et GAPDH (1 : 3 000 ; KangChen, Chine) à 4 °C pendant une nuit. Après plusieurs lavages, les membranes ont été mises à réagir avec IRDye 800 anti-rabbit Molecular Probe (1:8000, LI-COR Biosciences, USA) ou IRDye 700 anti-mouse Molecular Probe (1:3000, LI-COR Biosciences, USA) pendant 2 h. Les images ont été acquises avec le système d'imagerie infrarouge Odyssey (LI-COR Biosciences, USA) et analysées.

Le test de migration a été réalisé avec la chambre d'invasion BD matrigelTM (24 puits) selon les rapports précédents46. En bref, des suspensions d'astrocytes (2 × 106 / ml, 0, 2 ml contenant 1% de FBS) ont été ajoutées dans les inserts transwell, tandis que l'histamine à la concentration indiquée a été chargée dans les puits inférieurs contenant 5% de FBS. Après 24 h d'incubation, l'insert a été retiré du transwell et les cellules non migrantes ont été retirées en glissant doucement l'intérieur du transwell avec un coton-tige. Les cellules migrées ont ensuite été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % et colorées avec du cristal violet. Pour l'analyse quantitative, le nombre de cellules migrées dans chaque insert a été compté.

Les astrocytes à 3 × 105/ml ont été sous-cultivés dans 10-7 mol/L d'histamine pendant 30 min sur des plaques de culture 96 puits préalablement recouvertes de poly-L-lysine ou de laminine38. Après plusieurs lavages avec du PBS, les cellules ont été incubées avec du MTT (Sigma, USA, 0,5 mg/mL comme concentration finale) pendant 4 h à 37 °C. Ensuite, la couche surnageante a été retirée et 100 μL de diméthylsulfoxyde ont été ajoutés à chaque puits. Le métabolisme du MTT a été quantifié par spectrophotométrie à 570 nm par un lecteur de microplaques Biotek (USA).

Toutes les données ont été collectées et analysées en aveugle. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les scores de déficit neurologique au cours de chaque jour de test sont analysés par le test H non paramétrique de Kruskal-Wallis. D'autres données comportementales au cours de chaque jour de test ou de chaque test et d'autres comparaisons multiples lors d'examens pathologiques et d'expériences de culture cellulaire in vitro ont été analysées par ANOVA à un facteur suivi d'un test de Tukey, tandis que le test t de Student à deux queues a été appliqué pour d'autres comparaisons entre deux groupes. De plus, un modèle linéaire général a été utilisé pour analyser la différence de latence entre les différents groupes de traitement dans le test du labyrinthe aquatique de Morris, en tenant compte de tous les jours de test. Pour toutes les analyses, les tests étaient bilatéraux et un P < 0,05 était considéré comme significatif. Le calcul de la taille de l'échantillon est basé sur la formule : ; μα = 1,62(α = 0,05); μβ = 1,28(β = 0,10); σ = l'ET moyen ; δ = la différence moyenne entre les groupes.

Comment citer cet article : Liao, R.-J. et coll. L'histidine fournit une neuroprotection à long terme après une ischémie cérébrale en favorisant la migration des astrocytes. Sci. Rep. 5, 15356; doi : 10.1038/srep15356 (2015).

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Ce travail a été financé par la National Natural Science Foundation of China (81030061, 81273490, 81273506, 81473186), le National Basic Research of China 973 Program (2011CB504403), la Zhejiang Province Natural Science Foundation (LY12H31006) et le Program for Zhejiang Leading Team de l'innovation S&T (2011R50014). Nous sommes très reconnaissants à Muteflame Inc. (Windsor, Canada) pour l'édition linguistique.

Liao Ru-jia, Jiang Lei et Wang Rong-rong ont également contribué à ce travail.

Département de pharmacologie, Laboratoire clé de neurobiologie médicale du Ministère chinois de la santé, École des sciences médicales fondamentales, École de médecine, Université du Zhejiang, Hangzhou, 310058, Chine

Ru-jia Liao, Lei Jiang, Rong-rong Wang, Ying Chen, Ya Li, Lu Wang, Yu-dong Zhou, Xiang-nan Zhang, Zhong Chen et Wei-wei Hu

Département de pharmacologie, Centre d'innovation collaborative pour le diagnostic et le traitement des maladies infectieuses, Premier hôpital affilié, École de médecine, Université du Zhejiang, Hangzhou, 310003, Chine

Rong-rong Wang, Xiang-nan Zhang, Zhong Chen et Wei-wei Hu

Département de pharmacologie, Hôpital pour enfants de l'Université du Zhejiang, Hangzhou, 310006, Chine

Hua-wei Zhao

Département de radiologie, deuxième hôpital affilié, École de médecine, Université du Zhejiang, Hangzhou, 310009, Chine

Li-Yong Jie

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WWH et ZC ont proposé l'hypothèse, conçu les expériences et rédigé le manuscrit ; RJL, LJ, RRW, HWZ et LYJ ont réalisé les expériences ; RJL, YC, YL, LW et XNZ ont analysé les données ; YDZ a considérablement modifié le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

Liao, Rj., Jiang, L., Wang, Rr. et coll. L'histidine fournit une neuroprotection à long terme après une ischémie cérébrale en favorisant la migration des astrocytes. Sci Rep 5, 15356 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15356

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Reçu : 30 novembre 2014

Accepté : 09 septembre 2015

Publié: 20 octobre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep15356

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